文章来自“科学大院”大众号
作者：王曦
它是一种激素，也是医治贫血的奇特药物，它成果了生物技能的独角兽Amgen，也击退了环法七冠王，就在四天前，它又带来了诺奖。
（图片来历：veer图库）
2019年诺贝尔生理学或医学奖的三位得主William G. Kaelin, Jr.、Gregg L. Semenza和Sir Peter J. Ratcliffe早在2016年就以细胞对低氧感知与习惯机制的研讨斩获了诺奖风向标——拉斯克根底医学奖，所以也没有让人特别意外。三人发现和判定的要害分子低氧诱导因子1 （hypoxia-inducible factor 1, HIF-1）一时刻也在朋友圈爆红。今日咱们期望回到这一项研讨的起点——促红细胞生成素（erythropoietin，缩写EPO），一个奇特的分子。
它，是红细胞生成的最重要要素
红细胞是血液中数量最多的一种血细胞，是脊椎动物体内经过血液运送氧气和二氧化碳的最首要前言。红细胞在骨髓中生成：造血干细胞首要增殖分化为各类血细胞的祖细胞，其间红系祖细胞可以进一步分化老练为红细胞。正常情况下人类的红细胞生成速率很低，但在出血、溶血以及缺氧等钳制压力下，红细胞的生成速率乃至可以进步8倍。在这一过程中，促红细胞生成素EPO是最重要的要素，没有之一。
EPO是一种首要在肾脏组成的激素，化学实质是一种有高度糖基化润饰的蛋白质。为什么是在肾脏？每分钟有1升左右的血液流经肾脏，所以肾脏可以快速有效地监测到血液中氧含量的改变。当血液中氧含量较低时，肾脏就会快速呼应，许多组成EPO。后者经过血液循环进入骨髓，促进其间的红系祖细胞向红细胞的改变。老练的红细胞从骨髓中被开释到循环系统，以进步机体对氧气结合才能。肾脏感触到血液中氧气浓度添加后会削减EPO的组成，然后下降骨髓中的红细胞含量。
EPO调理红细胞生成示意图
（图片来历：修改自Simon JF and Nakhoul G.（2016）Cleve Clin J Med 83:613-624）
这就构成了一个完美的调理闭环。而高原日子的人以及一些贫血患者常常碰到血氧含量继续低的情况，就无法完结上述循环，影响肾脏继续排泄EPO，使其血液中的EPO浓度高于常人。
花了近80年才揭开它的真面目
和许多严峻发现相似，科学家对EPO的知道不是一往无前的，一路伴跟着质疑、应战。从EPO概念的提出到终究确认详细的分子花了挨近80年的时刻。
1906年，法国科学家Carnot 和Deflandre给正常的兔子输注了贫血兔子的血清后，发现正常兔子血浆里红细胞计数添加，他们以为血浆中某种体液因子可以影响调理红细胞的生成。这便是最早的EPO概念原型。惋惜的是随后几十年里研讨者并没有成功重复这一试验成果，一个的首要原因是其时对重生红细胞的计数定量并不精准。
1950年Reissmann和Ruhenstroth-Bauer的异种共生试验给出了真实有力的依据。他们经过外科手术将两只活体大鼠的循环系统衔接在一起，将其间一只置于低氧环境，另一只呼吸正常的空气，成果两只老鼠的体内都许多生成了红细胞。毫无疑问，血液循环系统中存在一种可以影响红细胞生成的激素，促红细胞生成素EPO由此得名。另一方面也阐明EPO对低氧十分活络。
EPO究竟是一个什么分子？美国科学家Goldwasser用了30年的时刻，终究在生物化学水平阐明晰这个问题。工欲善其事，必先利其器。EPO的功用是能影响重生红细胞，但后者的计数定量并不精准。红细胞里最首要的功用分子是含有血红素的血红蛋白，血红素分子中心含有一个亚铁离子，所以Goldwasser研讨组用放射性的铁同位素标记重生的红细胞，建立了活络检测EPO生机的办法，使得从动物体液样本别离纯化浓度极低的EPO（每毫升纳克级）变得或许。但EPO的别离仍是反常困难的，他们的研讨方针从肾脏换成贫血绵羊血浆、转向因钩虫感染而严峻缺铁的患者尿液，最终在1977年从2550升日本再生障碍性贫血患者的尿液中纯化得到8毫克的人EPO蛋白。
1985年，人源EPO的蛋白质测序以及基因克隆得以完结。EPO基因编码了一段193个氨基残基的多肽，在排泄过程中剪切掉信号肽后成为166个氨基酸残基组成的老练蛋白质，含有4个发作糖基化润饰的位点。1998年，EPO核磁共振溶液结构以及EPO及其受体复合物晶体结构得到解析。至此，人们对EPO才有了最直观的知道。
EPO的三维结构（PDB code：1BUY， PYMOL 软件出图），球状标明为糖基化位点
它，催生了制药巨子
在此之前，医治贫血一般需求经过输血弥补红细胞的缺少。跟着人们对EPO的知道不断深入，经过打针EPO影响本身骨髓的红细胞生成让问题变得愈加简略。但像Goldwasser那样直接从体液纯化EPO十分困难，产值也很低。而EPO蛋白质和基因序列的测定，使得许多出产重组人源EPO成为或许。
完结这一壮举的是一家叫做Applied Molecular Genetics（Amgen，安进）的生物技能公司。Amgen成立于1980年，一开端只要7名成员，他们期望用其时鼓起的分子生物学技能完成生物制药，在他们方针的清单上有干扰素、生长激素开释因子、乙肝疫苗、表皮生长因子这些炽热的姓名，可是这些测验无一成功。直到1985年，来自我国台湾的华人科学家林福坤克隆了人EPO的基因，然后运用DNA重组技能完成了人工组成的EPO出产。
重组人源EPO和人体内源的EPO蛋白质一级序列相同，也具有相似的糖基化润饰，天然也具有内源EPO的生机。1989年6月Amgen的第一个产品重组人红细胞生成素Epogen取得美国FDA同意，用于医治缓慢肾功用衰竭引起的贫血和HIV感染医治的贫血。Epogen销售额短短的三个月之内就突破了1600万美元。随后的20年里，Amgen在重组人源EPO商场里一向处于控制位置。仅2010年Epogen就给Amgen带来了高达25亿美元的收入。2018年，Amgen的股票市值1288亿美元，位列全球制药巨子第八位。
值得一提的是，Amgen一开端正是同Goldwasser协作，由Goldwasser供给纯化的人EPO蛋白进行测序，但很快Goldwasser和Amgen因理念不合而各奔前程。而从事根底研讨的Goldwasser及其地点的芝加哥大学历来都没有想过为他发现的这种激素申请专利，所以没有因为EPO商业上巨大的成功取得一分钱。
它，怎样就成了兴奋剂
在咱们呼吸过程中，氧气进入细胞的线粒体驱动呼吸链，一起许多发作ATP，这是咱们身体里能量的首要来历。贫血的人体内缺少满足的健康红细胞，最直接的影响是吸收的氧气缺少，令人觉得乏力，相似长距离跑力竭时呼吸不畅的感觉。打针重组人源EPO后，贫血患者的机体能发作更多的红细胞，运载更多的氧气，伴跟着更多能量分子ATP的发作，有效地缓解了症状。
可是某些体育竞技工作者也开端动重组人源EPO的歪脑筋了，假如用EPO类型人工重组激素影响运发动体内发作更多的红细胞，就有或许进步运发动获取氧气和发作能量分子的才能，也就可以进步运发动在自行车、长距离跑、越野滑雪等耐力项目中的成果。1980年《运用生理学》一篇论文表明，血液兴奋剂(促红细胞生成素、人工氧载体和血液回输等)可以使人体耐力添加34%。若运发动运用EPO，他们在跑步机上跑8公里的时刻将比之前缩短44秒。事实上，自行车和马拉松一向都是EPO类兴奋剂的重灾区。1998年环法自行车赛期间，西班牙费斯蒂纳车队的一名队医在法国边境被捕，她居然随身携带了400瓶人工重组EPO药物！成果当然是整支车队被踢出了环法并禁赛。
1992年巴塞罗那奥运会上，国际奥委会就把EPO列为了违禁药物名单，可是，重组人源EPO检测十分困难，在2000年奥运会之前乃至没有办法能有效地检测出运发动是否运用。原因有几种：1）人体液中EPO含量极低，正常人每毫升血液中EPO约为130-230纳克；2）人工重组EPO与人体内源EPO蛋白质氨基酸组成彻底相同，仅仅是糖基化方式有十分纤细的不同；3）EPO在血液中的半衰期仅为5-6小时，一般在最终一次打针的4-7天后就检测不到；4）EPO水平的个别差异性大，很难建立肯定的定量规范。
2000年开端，国际反兴奋剂机把尿检作为直接检测重组EPO仅有科学的验证办法。因为人工重组EPO与人体内源EPO糖基化方式的些微不同，两种分子的带电性质有十分小的不同，能用一种名为“等电聚集”的电泳办法区分隔，这是直接法检测人工重组EPO的首要战略。可是，某些用人来历细胞表达的重组EPO就没有糖基化不同，所以也有专家建议用碳同位素含量的不同区格外源EPO和内源EPO。
EPO是耐力性项目选手常常运用的违禁药物（图片来历：http://sportsscientists.com/wp-content/uploads/2013/02/EPO.jpg）
其实，现在不同的EPO检测办法都还存在限制，比方美国自行车传奇人物兰斯·阿姆斯特朗自己承认在7次夺冠的环法自行车赛中都服用了EPO及其他兴奋剂药物，但他实践没有在其时任何一次兴奋剂测验中被真实确以为EPO阳性。到底是“道高一尺”仍是“魔高一丈”，咱们还要拭目而待。
它，怎么成果诺奖
最终聊两句EPO和2019年诺贝尔生理学或医学奖间的联络。
EPO是人体感触并呼应低氧最典型的事例，所以Semenza和Ratcliffe这两位诺奖得主不谋而合挑选以EPO下手研讨细胞对低氧感知与习惯机制，第一步便是寻觅EPO基因可以呼应氧气改变的元件。Semenza在编码EPO蛋白的基因序列下流3’端找到一段256个碱基要害的非编码序列，命名为低氧应对元件（hypoxia response element）。假如骤变或删去这段元件序列，EPO蛋白就对低氧的呼应才能大大下降。假如把这段元件序列融合到其他与其他与低氧无关的基因下流3’端，这些改造后的基因在低氧条件下也呈现了相似EPO的激活。
随后Ratcliffe课题组发现，这一低氧应对元件并不只存在于担任生成EPO的肾脏或许肝脏细胞中，在其他更多的细胞类型中，都能在低氧条件下发挥作用。换句话说，这种对低氧的呼应或许并不是EPO所专有的，而是细胞中更广泛存在的一种现象。这些不担任生成EPO的其他细胞中必定含有某些分子（比方担任敞开基因表达的转录因子）可以感触到氧气浓度的改变，结合到低氧应对元件上敞开EPO等基因的表达。
细胞呼应低氧的分子机制。正常氧气条件下，低氧诱导因子HIF-1α被润饰反响添上了两个羟基（-OH），就可以被VHL辨认并打上了“待分化”标签，然后被蛋白酶体分化。低氧情况下HIF-1α的羟基化反响无法发作不会被降解能在细胞中安稳存在，和ARNT组组成缺氧诱导因子HIF，能结合到特定的低氧应对元件（HRE），敞开EPO相似基因的表达。（图片来历：https://ic.cn
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